分析方法學驗證中的檢測限和定量限

靈敏度（Sensitivity）是指某方法對單位濃度或單位量待測物質變化所引起的響應量變化程度。它可以用儀器的響應值或其他指示量與對應的待測物質的濃度或量之比來描述。它是分析方法的基本屬性，標志著方法的檢出能力，包括了檢測限和定量限。

定義和分類  

檢測限（Limit of Detection，LOD）：系指試樣中被測物能被檢測出的zui低量。檢測限僅作為限度試驗指標和定性鑒別的依據，沒有定量意義。因此需要注意的是在檢出限附近不能進行準確的定量，且報告未檢出時應附上方法的檢測限。

定量限（Limit of Quantitation，LOQ）：系指試樣中被測物能被定量測定的zui低量。對于微量或痕量藥物分析、定量測定藥物雜質和降解產物時，應確定方法的定量限。需要注意的是定量限的測定結果應符合準確度和精密度要求。同時定量限的濃度通常應小于等于報告限的濃度，以確保報告數值的準確可靠。

另外需要注意的是：

• 定量限/檢測限有些地方會翻譯為Quantitation limit，QL和Detection Limit，DL，這個根據各個公司自己規定執行即可。

• 在一些國外的質檢報告（COA）中可能會出現LOD表示為Loss On Drying（干燥失重）的縮寫，需要注意區分。

• 本文討論的檢測限均指的是分析方法的檢測限，對于儀器檢出限和方法檢出限的區別，我們后面再細細討論。

做法和要求    

1）直觀法

用已知濃度的被測物，試驗出能被可靠地檢測出的zui低濃度或量。

如薄層色譜TLC法，通過配制一系列已知濃度的樣品來試驗，直至能夠明顯觀察到斑點。

2）基于響應值標準偏差和標準曲線斜率法

通過多次空白測定和標準曲線的建立，分別獲得響應值偏差和標準曲線的斜率來計算得到zui低濃度。計算公式為：

如紫外分光光度法，通過配制空白和標曲溶液來測試，可分別獲得響應值偏差和標曲的斜率，然后計算得到LOD/LOQ。

3）信噪比法

用于能顯示基線噪聲的分析方法（最常見的就是色譜法），把已知低濃度試樣測出的信號與空白樣品測出的信號進行比較，計算出能被可靠地檢測出的被測物質zui低濃度或量。

一般以信噪比為 3 : 1 時相應濃度或量確定檢測限， 10：1時的量為定量限。

此處延伸一點就是信噪比計算中，噪音（Noise）常見的三種不同計算方式：

• 漂移線性回歸校準偏差SD 的六倍的噪聲（6*SD）

• 峰峰漂移修正間的噪聲（PtoP）

• 用ASTM 方法檢測的噪聲 (ASTM)

4）基于精密度和準確度的特定濃度

ICH Q2（R2）在原先幾種方法的基礎上提出了一個新的方法---基于準確度和精密度的方法下限。

（注：ICH Q2中提出了方法的工作范圍Working Range這個概念，并將線性和定量限/檢測限合并了，其中下限lower range limit即可理解為方法的定量限和檢測限。）

看原文：

4.2.2.3 Based on Accuracy and Precision at lower range limits

Instead of using estimated values as described in the previous approaches, the QL can be directly validated by accuracy and precision measurements.

不同于原先方法的估算濃度，定量限可以直接通過驗證方法的精密度和準確度來設定。

然后在此項的數據要求中，有這樣一段描述：

Also, the QL and the approach used for its determination should be presented.

相同的，定量限的濃度以及測定方法是需要明確指出來的。

If the QL was estimated, the limit should be subsequently validated by the analysis of a suitable  number of samples known to be near or at the QL. In cases where the QL is well below (e.g., approximately 10 times lower than) the reporting limit, this confirmatory validation can be omitted with justification.

如果定量限是估算出來的，那么這個限度濃度應該使用一系列已知的并且在定量限附近濃度的樣品來確認的。如果定量限遠小于報告限（如1/10或更低），那么它是可以不像前面的做法來做確認的，進行解釋說明即可。

For impurity tests, the quantitation limit for the analytical procedure should be equal to or below the reporting threshold.

對于雜質測定來說，分析方法的定量限應小于或等于報告限。

對此，個人理解ICH在傳遞的信息是：方法的靈敏度滿足使用需求即可（類似于Q3A中指出報告限的作用）。我們無需去證明方法的靈敏度有多高，只需要保證我們設定的特定限度滿足方法準確定量的要求即可。

隨著這個觀點的轉變，將使得LOD/LOQ從一個未知的濃度（需要估算或一系列實驗來摸索測定）變成了一個已知的濃度（特定的滿足使用要求的濃度），從解題變成了證明題，使得大家一下子變得輕松了許多。

實際上這個觀點，在國內很多人已經提出過并且也在被越來越多的人接受。原因就是在原先的要求下（既要滿足信噪比要求，又要滿足精密度和準確度要求），一方面兩者很難兼得，為達到要求往往需要耗費較多的精力；另一方面不同人員、不同儀器、不同時間、不同實驗室很難得出一個相同的濃度。因此大家在進行靈敏度驗證的時候就會變得非常糾結和痛苦。

采用這個新理念在具體的方法驗證過程中，對于定量限的驗證，需要做的就是選擇一個特定的濃度（通常以報告限為基礎，結合實際的控制限度，如報告限的一半或更低），然后用精密度和準確度的做法來驗證選定的定量限的這個濃度點。

文章最后，我們還需要再強調的一點就是：定量限是要保證精密度和準確度的！

因此定量限下的準確度和精密度是需要驗證的，驗證的可接受標準是不可以獨自放寬的。